近日，來自中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在國際知名期刊《Advanced Science》發(fā)表了題為“HMGB2-RAD21 Axis Promotes Fibro/Adipogenic Progenitor Proliferation and Regulates Fat Infiltration”的研究論文。該研究首次系統(tǒng)闡明了HMGB2通過轉(zhuǎn)錄激活RAD21調(diào)控纖維/脂肪祖細(xì)胞（FAPs）增殖的分子機(jī)制，為理解肌肉脂肪沉積的發(fā)育起源提供了新視角，也為豬肉品質(zhì)改良和肌肉脂肪相關(guān)疾病治療提供了潛在靶點(diǎn)。
肌肉脂肪的形成始于出生后，但數(shù)量決定在胚胎期
肌肉內(nèi)脂肪含量是影響豬肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素，也與多種肌肉疾病密切相關(guān)。纖維/脂肪祖細(xì)胞是肌肉中脂肪細(xì)胞的主要來源。
研究團(tuán)隊(duì)利用高肌肉脂肪含量的廣東小耳花豬模型，收集了從胚胎期到成年期多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的背最長肌樣本，通過組織染色發(fā)現(xiàn)：肌肉脂肪細(xì)胞最早在出生后第2天才出現(xiàn)，之后逐漸增多（圖1B、1C）。
然而，轉(zhuǎn)錄組分析提示，脂肪分化的“準(zhǔn)備”工作早在胚胎晚期就已啟動(dòng)（圖1F、1G）。
圖1 骨骼肌肌間脂肪細(xì)胞分化的時(shí)間動(dòng)態(tài)
（A）收集廣東小耳花豬在八個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的背最長肌樣本：胚胎日（E）和出生后日（P）。
（B）不同發(fā)育階段背最長肌樣本的油紅O染色。
（C）不同發(fā)育階段背最長肌樣本的Perilipin免疫熒光染色。
（D）肌間脂肪細(xì)胞數(shù)量的定量分析。
（E）肌間脂肪細(xì)胞大小的定量分析。
（F）熱圖顯示16個(gè)共表達(dá)模塊中基因的表達(dá)模式（每個(gè)發(fā)育階段包含三個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。
（G）模塊7、12和13的表達(dá)變化及GO富集分析。左側(cè)面板顯示每個(gè)模塊基因在骨骼肌發(fā)育過程中的中位數(shù)Z評(píng)分，右側(cè)面板列出與每個(gè)模塊相關(guān)的前五個(gè)或四個(gè)典型GO生物學(xué)過程條目。
（H、I）葡萄糖代謝相關(guān)基因 （GLUT4）和脂肪生成相關(guān)基因（DLK1、C/EBPβ和ATGL）在骨骼肌發(fā)育過程中的FPKM水平變化。
單細(xì)胞圖譜揭示FAPs^HMGB2+ 亞群是關(guān)鍵增殖群體
為進(jìn)一步探究FAPs的發(fā)育起源，團(tuán)隊(duì)對(duì)胚胎期和新生期豬肌肉組織進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序，構(gòu)建了首個(gè)豬胚胎期FAPs發(fā)育圖譜（圖2A）。通過無監(jiān)督聚類和擬時(shí)序分析，研究者發(fā)現(xiàn)一個(gè)高表達(dá)HMGB2的FAP亞群（FAPs^HMGB2+）主要處于活躍增殖狀態(tài)（圖2C、2D），位于分化軌跡的起點(diǎn)（圖2G），之后分化為成脂和成膠原兩個(gè)方向（圖2J、2K）。
圖2?胚胎骨骼肌發(fā)育過程中FAPs亞群的發(fā)育軌跡
（A）豬肌肉組織準(zhǔn)備、單細(xì)胞分離及單細(xì)胞RNA測(cè)序流程示意圖。
（B）基于圖的聚類分析顯示分離的單細(xì)胞形成代表不同細(xì)胞群的獨(dú)立聚類。
（C）基于圖的聚類分析顯示FAPs群體中存在兩個(gè)不同的亞群：FAPs^HMGB2-?和?FAPs^HMGB2+。
（D）FAPs^HMGB2+?亞群中代表性基因的表達(dá)情況。
（E）FAPs^HMGB2+?亞群高表達(dá)基因的GO富集分析。
（F）不同FAPs亞群中各細(xì)胞周期時(shí)相的比例。
（G）通過Monocle 2對(duì)FAPs進(jìn)行擬時(shí)序分析，揭示三種不同的細(xì)胞狀態(tài)：前分支狀態(tài)、細(xì)胞命運(yùn)1和細(xì)胞命運(yùn)2。細(xì)胞狀態(tài)的分布沿?cái)M時(shí)序軌跡呈現(xiàn)，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞。
（H）熱圖顯示按擬時(shí)序排列的3941個(gè)主要差異表達(dá)基因的表達(dá)變化，這些基因被劃分為四個(gè)呈現(xiàn)不同表達(dá)模式的主要簇。
（I）增殖相關(guān)基因（如Ki67、CENPF和Top2A）的動(dòng)態(tài)表達(dá)。
（J、K）成脂和成膠原相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)。
FAPs^HMGB2+亞群的比例隨發(fā)育進(jìn)程逐漸下降，至出生后幾乎消失（圖3A-3D），提示胚胎期FAPs的增殖活性直接決定了出生后FAPs庫的大小，進(jìn)而影響肌肉脂肪的沉積潛力。
免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)，FAPs^HMGB2+細(xì)胞在早期胚胎階段（E35）呈現(xiàn)Ki67陽性，表明其正處于活躍增殖狀態(tài)（圖3G、3H）。
圖3 FAPs^HMGB2+ 在豬骨骼肌發(fā)育的胚胎階段占主導(dǎo)地位
（A）UMAP圖顯示不同發(fā)育階段骨骼肌中FAPs亞群的分布。
（B）各發(fā)育階段FAPs^HMGB2+ 占FAPs總數(shù)的比例。
（C和D）對(duì)GDSS豬在E35、E50、E73、E99、P2和P9時(shí)期的背肌橫斷面石蠟切片進(jìn)行HMGB2和PDGFRα免疫熒光共染，并對(duì)FAPs中FAPs^HMGB2+ 的比例進(jìn)行定量分析。
（E）不同發(fā)育階段FAPs分化軌跡的可視化。
（F）各發(fā)育階段骨骼肌中處于三種細(xì)胞狀態(tài)（前分支、細(xì)胞命運(yùn)1和細(xì)胞命運(yùn)2）的FAPs比例。
（G）對(duì)早期骨骼肌樣本（E35）進(jìn)行PDGFRα、HMGB2和Ki67的多重免疫熒光染色。
（H）對(duì)早期骨骼肌樣本（E35）中FAPs^HMGB2+ 群體內(nèi)Ki67陽性細(xì)胞的比例進(jìn)行定量分析。
HMGB2敲除導(dǎo)致FAPs減少，脂肪浸潤能力下降
圖5 HMGB2調(diào)控FAPs的增殖能力
（A）對(duì)胚胎發(fā)育和肌肉損傷過程中FAPs^HMGB2+?的KEGG通路分析。
（B）HMGB2表達(dá)與細(xì)胞周期通路的變化趨勢(shì)。
（C）體外培養(yǎng)的小鼠FAPs（CD31-CD45-PDGFRα+）中PDGFRα和HMGB2的免疫熒光共染。
（D）8周齡對(duì)照、HMGB2+/? 和?HMGB2?/? 雄性小鼠的代表性圖像。比例尺?= 1 cm。
（E）8周齡不同基因型雄性小鼠的體重（每種基因型?n = 6）。
（F）胚胎第14天（E14）肌肉中HMGB2和PDGFRα的免疫熒光共染。
（G）不同基因型中FAPs^HMGB2+?的比例。
（H）通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)8周齡不同基因型小鼠脛骨前肌中FAPs進(jìn)行定量分析。
（I）8周齡不同基因型小鼠脛骨前肌中FAPs的比例。
（J）基于免疫熒光染色鑒定8周齡不同基因型小鼠脛骨前肌中的FAPs含量。
（K）FAPs含量的定量分析。
在肌肉損傷模型中，HMGB2敲除小鼠的肌肉脂肪浸潤能力顯著減弱（圖6A-6D）。在衰老模型中也觀察到類似趨勢(shì)（圖6E、6F），同時(shí)肌肉纖維化程度也明顯降低（圖6G、6H），表明HMGB2是調(diào)控FAPs增殖和脂肪沉積能力的關(guān)鍵分子。
圖6?骨骼肌中FAPs減少對(duì)肌肉損傷和衰老的影響
（A）通過Perilipin免疫熒光染色檢測(cè)野生型、HMGB2+/? 和?HMGB2?/? 小鼠在甘油損傷后第7、14和21天骨骼肌中的脂肪浸潤情況。
（B）損傷后第7天肌肉橫切面中Perilipin陽性區(qū)域的定量分析（n = 3）。
（C）損傷后第14天肌肉橫切面中Perilipin陽性區(qū)域的定量分析（n = 3）。
（D）損傷后第21天肌肉橫切面中Perilipin陽性區(qū)域的定量分析（n = 3）。
（E）通過Perilipin免疫熒光染色評(píng)估16月齡小鼠骨骼肌中的脂肪浸潤情況。
（F）衰老模型肌肉橫切面中Perilipin陽性區(qū)域的百分比（n = 3）。
（G）通過Masson染色評(píng)估肌肉中的膠原沉積情況（衰老模型，16月齡）。
（H）衰老模型肌肉橫切面中Masson陽性區(qū)域的百分比（n = 3）。
機(jī)制解析：HMGB2直接激活RAD21轉(zhuǎn)錄
在機(jī)制層面，研究者發(fā)現(xiàn)HMGB2通過結(jié)合RAD21啟動(dòng)子區(qū)域（圖8L），直接激活其轉(zhuǎn)錄。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)HMGB2在RAD21啟動(dòng)子上顯著富集（圖8M）。RAD21是黏連蛋白復(fù)合物的核心亞基，參與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期調(diào)控。
體外敲低HMGB2或RAD21均導(dǎo)致FAPs增殖能力下降（圖8B-8G），而過表達(dá)RAD21可部分挽救HMGB2敲低引起的增殖缺陷（圖8H-8K）。這一HMGB2-RAD21軸的發(fā)現(xiàn)，為理解FAPs增殖的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新線索。
圖8 HMGB2直接結(jié)合RAD21啟動(dòng)子并激活其轉(zhuǎn)錄
（A）HMGB2和RAD21在FAPs發(fā)育軌跡中的表達(dá)趨勢(shì)。
（B、C）轉(zhuǎn)染si-HMGB2后小鼠FAPs的EDU染色。
（D）轉(zhuǎn)染si-HMGB2后通過qPCR檢測(cè)HMGB2、RAD21、Cyclin E1和Cyclin D1的mRNA水平（n = 3）。
（E、F）轉(zhuǎn)染si-RAD21后小鼠FAPs的EDU染色。
（G）轉(zhuǎn)染si-RAD21后通過qPCR檢測(cè)HMGB2、RAD21、Cyclin E1和Cyclin D1的mRNA水平（n = 3）。
（H）轉(zhuǎn)染si-HMGB2和pCDNA3.1-RAD21后小鼠FAPs的EDU染色。
（I）EDU陽性細(xì)胞的定量分析。
（J）通過qPCR檢測(cè)HMGB2、RAD21、Cyclin E1和Cyclin D1的mRNA水平（n = 3）。
（K）FAPs的實(shí)時(shí)增殖指數(shù)。
（L）使用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)RAD21啟動(dòng)子區(qū)域（-2000至+0 bp）內(nèi)的HMGB2結(jié)合位點(diǎn)。
（M）通過ChIP-qPCR分析對(duì)照細(xì)胞和KLF4敲低細(xì)胞中HMGB2在RAD21啟動(dòng)子上的富集情況。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為輸入樣本的百分比。
（N）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖：擴(kuò)增RAD21啟動(dòng)子序列（-2000至+0 bp），刪除預(yù)測(cè)的結(jié)合區(qū)域"ATATTA"，并插入攜帶螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的雙熒光素酶報(bào)告載體pCIG中。
（O）在293T細(xì)胞中進(jìn)行的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，細(xì)胞共轉(zhuǎn)染含有野生型或突變型RAD21啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒和pCDNA3.1-HMGB2載體（n = 3）。
研究意義與展望
該研究首次從發(fā)育生物學(xué)角度闡明了肌肉脂肪沉積的細(xì)胞起源和分子調(diào)控機(jī)制，不僅為豬的分子育種提供了新的候選基因，也為肌營養(yǎng)不良、2型糖尿病等疾病中的病理性脂肪浸潤干預(yù)提供了潛在靶點(diǎn)。研究團(tuán)隊(duì)表示，后續(xù)將進(jìn)一步探索FAPs特異性調(diào)控策略，以期在改善肉質(zhì)和治療肌肉疾病之間找到平衡點(diǎn)。
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202514363
研究背后的實(shí)驗(yàn)保障
在整個(gè)研究過程中，精準(zhǔn)的基因表達(dá)分析是驗(yàn)證機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
研究團(tuán)隊(duì)使用了東盛生物GDSBio的SYBR Green qPCR Mix（P2091/P2092/P2093/P2094），在羅氏LightCycler 480 II系統(tǒng)上完成了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，包括基因敲除小鼠模型的驗(yàn)證、siRNA干擾效率的評(píng)估、ChIP-qPCR中對(duì)低豐度DNA模板的精確定量，為研究數(shù)據(jù)的可靠性提供了堅(jiān)實(shí)保障。
SYBR Green qPCR Mix系列是東盛生物經(jīng)典的染料法熒光定量PCR預(yù)混液，經(jīng)過長期的市場(chǎng)檢驗(yàn)及持續(xù)的改進(jìn)優(yōu)化，產(chǎn)品性能優(yōu)異，質(zhì)量穩(wěn)定，擁有眾多海內(nèi)外穩(wěn)定用戶。同時(shí)，該系列依據(jù)ROX參比染料提供形式的不同有多種規(guī)格供選擇：
#P2091 SYBR Green qPCR Mix (NO ROX)：不含ROX
#P2091a SYBR Green qPCR Mix (Low ROX+)：預(yù)混低濃度ROX
#P209b SYBR Green qPCR Mix (High ROX+)：預(yù)混高濃度ROX
#P2091c SYBR Green qPCR Mix (with ROX+)：獨(dú)立包裝ROX
產(chǎn)品支持免費(fèi)試用，同時(shí)有多種選擇，滿足不同的使用需求。
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